2013年5月8-11日,第12届骨髓增生异常综合征(MDS)国际研讨会在德国柏林召开(图)。该研讨会每2年举办1次,主要关注于骨髓增生异常综合征(MDS)相关的研究成果。此次研讨会汇聚了来自世界各地MDS领域的专家,大家就该领域的热点问题展开了深入的讨论。同时,研讨会上公布了诸多MDS领域最新研究进展,内容覆盖MDS的生物学、诊断及治疗。

肖志坚:MDS发病分子机制、预后和表观遗传学治疗进展

作者:中国医学科学院血液病医院 肖志坚

                肖志坚教授

■ MDS基因突变

MDS是一组克隆性造血干细胞疾病,其特征是血细胞减少,髓系细胞一系或多系发育异常(dysplasia),无效造血(ineffective haematopoiesis)及演变为急性髓系白血病(AML)的风险增高。MDS主要病理生理本质是:

①起源于造血干细胞的克隆性疾病;

②粒系、红系和巨核细胞系一系或多系发育异常;

③无效造血。临床表现主要是外周血一系或多系血细胞计数减少及由此导致的症状和体征,疾病结局是骨髓衰竭或演变为AML。MDS的发生和演变是一个多步骤累及多基因的病理过程。

通过单核苷酸多态性(SNP)微阵列技术和全基因组或外显子组测序,发现了大约25~30种参与MDS发生的基因突变。在继之前发现的癌基因、抑癌基因及转录因子编码基因突变的基础上,新近发现2大类基因突变,分别涉及表观遗传学调节子编码基因和剪切体复合物蛋白编码基因(表 1)。对于不同的患者,这些基因突变可以不同的组合同时存在。表观遗传学调节子编码基因在MDS和AML之间存在明显的重叠,而RNA剪切体复合物蛋白编码基因突变在MDS更常见。

            表1 MDS基因突变的频率及功能

TET2基因突变广泛存在于血液系统恶性肿瘤中,如MDS(25%)、AML(10%)、骨髓增殖性肿瘤(MPN,10%~30%)及慢性粒单核细胞白血病(CMML,50%)等。 TET2基因编码蛋白可诱导去甲基化反应,该过程还需亚铁离子(Fe2+)和α-酮戊二酸(α-KG)参与,后者为异柠檬酸脱氢酶(IDH)催化异柠檬酸氧化脱羧的产物,存在IDH1或2基因突变则可抑制TET2蛋白的功能,因此,TET2基因突变和IDH1或2基因突变往往相互排斥。研究证实,TET2基因突变可能与去甲基化药物治疗有效相关。此外,一项大型队列研究已证实,EZH2基因突变与MDS患者预后差相关。在发现的SF3B1、SRSF2、U2AF1及ZRSR2等剪切体复合物蛋白编码基因中,仅SF3B1基因突变与环状铁粒幼红细胞增多性贫血密切相关,是该亚型的主要致病基因,且伴该基因突变的患者预后较好。


■ 修订的国际预后评分系统(IPSS-R)

1997年提出MDS国际预后评分系统(IPSS),2005年基于世界卫生组织(WHO)分型标准(2001)提出了WHO预后评分系统(WPSS)。近年,对这2个系统中细胞遗传学预后分组进行了修订:

①非常好:11号染色体长臂缺失[del(11q)],-Y;

②好:正常,der(1;7),del(5q),del[12短臂(p)],del(20q),伴del(5q)的2种异常;

③中等:7q-,+8,i(17q),+19,任何其他单独异常或2个独立的克隆;

④差:-7,inv(3)/t(3q)/del(3q),包含-7/7q-的2种异常,3种异常;

⑤非常差:3种以上异常。

2011年WPSS进行了修订,将是否红细胞输血依赖改为是否有严重贫血(男性<90 g/L,女性<80 g/L)。2012年提出了IPSS-R:原始细胞按≤2%、>2%~<5%、5%~10%和>10%~30%进行划分;染色体核型预后分组采用前述5组分法;细化了血细胞减少的分组;将年龄、一般状况、血清铁蛋白、乳酸脱氢酶、和β2微球蛋白等临床和实验室参数作为暂定预后因素。IPSS-R预后危度分组分为极低危、低危、中危、高危和极高危5组,其中位生存期分别为6.8、4.3、2.3、1.5及0.9年,发生AML转化的中位时间分别为未达到、未达到、15.7、4.8及2.6年。


■ 表观遗传学治疗

主要包括DNA甲基化和组蛋白去乙酰化,前者通过甲基化修饰,可抑制基因表达,后者通过组蛋白去乙酰化改变染色质结构影响DNA转录活性,由于DNA和(或)组蛋白的表观遗传学改变导致与细胞分化和抑制肿瘤生长相关的基因“沉默”,这些表观遗传学改变具有可逆性,即在DNA甲基转移酶抑制剂(如地西他滨)和去乙酰化酶抑制剂的作用下可发生逆转,表观遗传学治疗的研究也日益受到高度重视。

表观遗传学异常是MDS发生和演变的主要分子机制之一。2010年一项研究表明,DNA甲基化可预测MDS患者的生存和治疗反应,该研究以CpG岛甲基化表型(CIMP)确定具有甲基化表型的MDS患者,结果表明,CIMP的出现与MDS患者预后差及白血病转化风险显著相关,基线甲基化水平与地西他滨治疗反应无显著相关,甲基化水平下降的持续时间与更好的临床疗效相关。此外,研究亦表明,在中高危患者,地西他滨可显著延长MDS患者的无进展生存(PFS)期。近期发表于《临床肿瘤学杂志》(Journal of Clinical Oncology)的一项Ⅱ期临床研究评价了在低危和中危-1的MDS患者中给予小剂量地西他滨皮下注射治疗的有效性。该项研究纳入65例患者,分为2组,分别给予方案A(地西他滨20 mg/m2,第1、2、3天皮下注射,每28天1疗程)和方案B(地西他滨20 mg/m2,第1、8、15、22天皮下注射,每28天1疗程)治疗。中位随访14.6个月。结果显示,方案A组中67%的患者、方案B组中59%的患者摆脱红细胞和血小板输注依赖,约70%的患者生存期可达500天。


李晓:CMML的表观遗传学治疗进展

          作者:上海交通大学附属第六人民医院 李晓

■ CMML治疗现状

慢性粒单核细胞白血病(CMML)兼具骨髓增殖性肿瘤(MPN)和骨髓异常增生综合征(MDS)的特点,因此,CMML也被定义为MPN/MDS重叠综合征。患者的临床表现、生存期及血常规检查等具有多样性。一般而言,患者的中位OS期约20个月,且可能与骨髓原始细胞的比例有关。15%~30%的CMML患者可进展为AML。目前,对于CMML的治疗,主要局限于抗增殖药物,仅针对CMML中的MPN亚型。此外,尽管20%~30%的CMML存在克隆性细胞遗传学异常,但这些异常并非是CMML特异性的改变,而大多数患者表现为核型正常。最近的生物学研究亦未对治疗手段产生有效的影响,尚无较好方法使患者获得有效缓解。


■ 表观遗传学治疗进展

在第12届MDS国际研讨会上公布的一项最新研究表明,地西他滨治疗CMML患者有效,完全缓解(CR)+骨髓完全缓解(mCR)率可达40.5%。同时,通过持续的去甲基化作用,增加地西他滨治疗疗程,患者的缓解率可获得进一步提高。该研究纳入44例CMML患者,给予地西他滨[20 mg/(m2·d),5天,每28天]治疗至少6个周期。在治疗4和6周期后,根据2006年国际工作组(IWG)标准进行患者缓解评估。结果显示,根据世界卫生组织(WHO)分类,在43例进行评估的患者中,CMML-Ⅰ型27例、CMML-Ⅱ型16例。患者中位年龄71岁,中位治疗时间8周期。其中,11例患者治疗<4周期、17例患者治疗4~6周期、15例患者治疗>6周期。81%的CMML-Ⅰ型患者治疗>4周期。治疗4周期后,14%的CMML病例CR;18.6%的CMML病例mCR;2.3%的CMML病例部分缓解(PR);34.9%的CMML病例疾病稳定(SD)。继续给予地西他滨治疗2个周期后,CR率上升至16.2%;mCR率上升至24.3%;SD率下降至18.9%;CR+mCR率达到40.5%。患者停止地西他滨治疗的主要原因为疾病进展(35%)、死亡(23%)及药物的毒性反应(7%)。目前,7例(16.3%)患者仍在治疗中。患者治疗6个周期后,达到缓解的患者缓解持续时间为9.7个月。43例可评估患者中,7例患者发生严重感染、3/4级心脏及胃肠道毒性反应各1例。从该项CMML患者的小样本队列研究中,研究者未获得可能预测患者疾病缓解的临床特征或细胞遗传学改变。

是否对CMML患者进行地西他滨治疗,可参照2007年阿里比(Aribi)等在《癌症(Cancer)》杂志发表的文章。该文建议以下情况应考虑给予地西他滨治疗:

①出现CMML临床表现,如发热、体重减轻、脾肿大、白细胞增多等症状和体征程度严重;

②血细胞进行性减少,如贫血、血小板减少、输血依赖;

③CMML累及器官,如皮肤损伤、肾功能不全、肺部症状等;

④原始细胞数量增多,骨髓原始细胞增至5%或10%以上。


■ CMML基因突变的相关研究

80%的CMML患者存在分子遗传学异常,最常见的基因突变为TET2(58%)、SRSF2(46%)及ASXL1(40%)。近期的研究显示,RNA剪切相关基因突变在髓性恶性肿瘤的发生过程中起重要作用。在伴有环状铁粒幼红细胞(RS)的MDS患者中,SF3B1基因突变最为常见(75%~80%)。而SRSF2剪切基因突变主要与CMML相关。在第12届MDS国际研讨会上公布的另一项旨在评估SRSF2基因突变频率的中国研究亦证实,SRSF2基因突变是CMML患者中最主要的剪切突变,且与患者年龄大及预后差相关。该项研究纳入20例CMML患者,应用聚合酶链式反应(PCR)联合直接测序的方法检测基因突变。结果显示,男性患者11例、女性患者9例,平均年龄62岁。4例患者(20%)存在SRSF2基因突变,而非SF3B1基因突变。其中3例患者为P95H、1例患者为P95L。存在SRSF2基因突变的患者年龄较大,平均为70.5岁。1例SRSF2基因突变的患者进展为AML。此外,研究者认为,地西他滨可能缓解存在SRSF2基因突变患者的贫血和血小板减少,但还需更大样本的研究。

在第12届MDS国际研讨会上还公布了其他多项与CMML相关的研究。其中,一项研究评价了单核苷酸多态性(SNP)阵列在低危CMML患者诊断和预后预测中的作用。该研究表明,SNP阵列可检测到传统细胞遗传学方法无法检测的染色体异常。应用该法进行一系列患者的检测有助于更好地了解CMML的疾病特征。此外,另有一项研究发现,在存在TET2基因突变的CMML患者中,调节性T细胞(Tregs)可显著升高,意义有待进一步探索。随着对CMML研究的深入,CMML治疗现状必将逐步获得更大的改观。


MDS鼠动物模型建立及去甲基化药物疗效观察

中国医学科学院血液病医院 张悦 肖志坚 美国辛辛那提儿童医院医学中心 黄刚


    黄刚教授在第12届MDS国际研讨会上发言


■ MDS分子遗传学改变及建立鼠动物模型

根据形态学改变及原始细胞比例,2008年修订的世界卫生组织(WHO)分类标准将MDS 分为:难治性血细胞减少伴单系发育异常(RCUD)、难治性贫血伴环状铁粒幼细胞(RARS)、难治性血细胞减少伴多系发育异常(RCMD)、难治性血细胞减少伴原始细胞增多-1(RAEB-1,原始细胞5%~9%)、难治性血细胞减少伴原始细胞增多-2(RAEB-2,原始细胞10%~19%)、MDS伴单纯5q-以及MDS不能分类(MDS-U)。

近年的研究表明,正常造血干或祖细胞获得多种遗传性体细胞突变和(或)表观遗传学异常(DNA甲基化,组蛋白乙酰化)导致细胞自我更新以及分化、成熟异常,形成恶性造血干细胞克隆是MDS及AML的发病基础。目前已知分子事件主要集中在转录因子、信号转导途径、表观遗传学修饰及干细胞微环境等方面,包括TET2、NRAS、KRAS、CBL、ETV6、EZH2、ASXL1、TP53、RUNX1、FLT3、MLL-PTD、WT1、SF3B1以及SRSF2等。

转录调控因子RUNX1突变在AML及MDS患者发生率较高,分别为13.1%和17.5%。RUNX1基因编码RUNX1蛋白,与CBFβ相结合形成核心结合因子转录复合体,调控多个造血相关基因表达。目前累及RUNX1突变主要为2类:

①发生在RUNX1 N-末端(常见突变RUNX1D171N),主要在RHD结构域,影响RUNX1与DNA结合;

②发生在RUNX1 C-末端(常见突变RUNX1s291fs),可增强RUNX1与DNA结合,但影响其转录活性。MLL基因异常是另一种MDS及MDS/AML常见的遗传学改变。MLL蛋白依赖甲基转移酶活性介导染色质修饰,从而调节相关基因表达。除累及MLL的染色体异位外,另一类MLL异常主要表现为MLL部分串联重复(MLL-PTD)。AML患者的MLL-PTD发生率为7.5%,MDS发生率为4.2%。研究表明,MDS患者疾病进展时常同时存在MLL-PTD及RUNX1 突变,且在原发和继发性AML中,同时存在突变的比例更高。由此假设,RUNX1突变与MLL-PTD具有协同作用,可导致MDS发生及AML转化。

为进一步证实上述假设,研究者在MLL-PTD 敲入(knock-in)小鼠基础上联合RUNX1不同突变,构建以下3种MDS/AML小鼠动物模型:

①MLL-PTD/RUNX1-/-模型;

②MLL-PTD/RUNX1- D171N BMT模型;

③MLL-PTD/RUNX1-291fs BMT 模型。首先,应用Mx1-Cre,在MLL-PTD knock-in小鼠体内敲除RUNX1等位基因,pIpC诱导1个月后,PTD/RUNX1-/-小鼠即出现显著血小板减低,2~4个月后出现大细胞性贫血及白细胞减低。骨髓及外周血形态学分析发现粒系、红系和巨核系发育异常的特征性改变。多数PTD/RUNX1-/-小鼠在8个月内死亡,中位生存期149天。其次,通过构建RUNX1D171N和RUNX1s291fs逆转录病毒质粒,感染野生型小鼠(WT)及MLL-PTD knock-in小鼠骨髓细胞,建立移植鼠模型。移植鼠除具有大细胞性贫血、血小板减少以及形态学发育异常表现外,骨髓中常表现为原始细胞增多(尤以MLL-PTD/RUNX1-291fs 移植鼠显著),系列骨髓移植显示,MLL-PTD/RUNX1-291fsMDS疾病表型具有可移植性,但并不能发生AML转化。


■ 去甲基化药物的疗效

既往研究显示,MDS患者多个基因处于高甲基化状态,因此,美国食品与药物管理局(FDA)批准甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine)及5-氮杂-2’-脱氧胞苷(地西他滨)用于MDS治疗。后者可逆转DNA CpG岛胞嘧啶异常高甲基化状态,使由于高甲基化导致基因“沉默”的肿瘤抑制基因重新激活,从而发挥肿瘤抑制作用。临床试验结果显示,地西他滨对中、高危MDS及MDS/AML有效,其有效率30%~73%不等。通过运用斑点杂交(Dot Blot)检测,研究者检测了MLL-PTD/RUNX1-291fs 移植鼠lin-Kit+造血干细胞5-mc和5-hmc表达,结果显示,与对照组相比,MLL-PTD/RUNX1-291fs 移植鼠lin-Kit+造血干细胞5-mc表达明显增强,提示其DNA甲基化水平增高。应用小剂量地西他滨(0.3 mg/kg,皮下注射,每周2次)治疗MLL-PTD/RUNX1-291fs 移植鼠,其生存期明显长于生理盐水对照组[(94.5±6.4)天对(53.5±3.5)天,P<0.001]。取MLL-PTD/RUNX1-291fs移植鼠骨髓细胞进行体外系列集落培养,并给予地西他滨(0.5 μM)药物处理,结果显示地西他滨处理组集落数量明显减少(34±7.7 对619±30.5,P<0.001), 且促进细胞分化;但对于MDS初始细胞(MICs),地西他滨单药处理作用有限,无法明显减少MICs数量及集落形成能力,可能是临床上地西他滨耐药的可能机制之一。


中国专家与德国乌韦·普拉茨贝克教授(欧洲血液病学MDS工作组共同主席)见面会

综上所述,MDS小鼠动物模型的建立不仅有助于MDS发病机制研究,同时为MDS新治疗策略的实施提供有益的手段。此外,尽管小剂量地西他滨治疗可通过促进细胞分化而延长MLL-PTD/RUNX1-291fs移植鼠生存期,但地西他滨单药治疗对于MICs疗效有限,进一步联合其他药物用以针对MICs,可提高疗效。

                                                       来源:医脉通