[摘要] 目的:应用直接基因测序为β地中海贫血稀有突变患者进行产前基因诊断。方法:产前行常规血液学筛查,对怀疑β地中海贫血的患者行反向点杂交检测常见的17种突变,对未发现突变的患者采用直接基因测序,确证是否携带β地中海贫血稀有突变,对同时携带稀有β地中海贫血基因突变的夫妇取孕妇脐血或行羊水产前基因诊断。结果:为两对携带稀有β地中海贫血基因突变的夫妇行产前基因诊断,其中一对夫妇的丈夫为CD41-42(-TTCT)杂合突变,孕妇为CD6(GAG→AAG)/N杂合突变,胎儿羊水为CD6(GAG→AAG)/N杂合突变;第二对夫妇的丈夫为CD22(GAA→GCA)/N杂合突变,孕妇为CD56(GGC→GAC)/N杂合突变,胎儿脐血未发现突变。
结论:联合反向点杂交和直接基因测序技术可为携带稀有β地中海贫血基因突变的夫妇提供产前基因诊断。

 
  [关键词] 地中海贫血;产前诊断;稀有突变;CD6;CD56;CD22 

  [中图分类号] R596.2 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721(2010)03(a)-015-03 
   
  Prenatal diagnosis for the rare beta-thalassemia mutation carriers with DNA sequencing 
  SONG Chunlin*,FAN Juhua,CHEN Shufen,GUO Xiaoling 
  (Clinical Laboratory of Foshan Maternal and Children′s Healthcare Hospital of Foshan,Foshan528000,China) 
  [Abstract] Objective: Prenatal diagnosis was performed for the rare beta-thalassemia mutation carriers by direct DNA sequencing of the entire β-globin gene. Methods: Screened the couples by cell counter and hemoglobin analysis, then identified the commonest known 17 types mutation by reverse blot dot. For the doubtful patient who was not detected mutation,direct DNA sequencing of the entire β-globin gene. Prenatal diagnosis was performed for the couples who was identified as rare beta-thalassemia mutation carriers. Results: One pregnant was heterozygote of CD6(GAG→AAG)/N and her husband was heterozygote of CD41-42(-TTCT),her fetus was heterozygote of CD6(GAG→AAG)/N.The other pregnant was CD56 (GGC→GAC)/N heterozygote of and her husband was heterozygote of CD22(GAA→GCA)/N,her fetus was not detected any reported mutation. Conclusion: Direct DNA sequencing of the entire β-globin gene is a effective technology of prenatal diagnosis for the rare beta-thalassemia mutation carriers. 
  [Key words] Thalassemia; Prenatal diagnosis; Rare mutation; CD6; CD56; CD22 
   
  地中海贫血是我国南方最常见和危害最大的单基因遗传病之一,重型β地中海贫血一般在出生后3~6个月出现症状,需要靠频繁地输血和去铁治疗维持生命,多在成年前夭折。目前主要以聚合酶链反应结合反向点杂交芯片技术检测中国人常见的17种β地中海贫血突变。还有一部分患者携带稀有β地中海贫血突变,若其配偶也携带β地中海贫血突变,容易被忽略,有可能诞生中重度β地中海贫血的患儿。笔者利用直接基因测序方法,发现一些稀有β地中海贫血突变患者,并为两对双方均携带β地中海贫血的夫妇做了产前诊断。 
  1 资料与方法 
  1.1 一般资料 
  来本院产前诊断的孕妇及其丈夫,筛查并基因测序确诊两对夫妇(A夫妇和B夫妇)携带稀有β地中海贫血突变,两对夫妇自愿要求行产前基因诊断。A夫妇为广东省深圳市籍贯,B夫妇为广东省佛山市人。 
  1.2 地中海贫血筛查 
  用血细胞全自动分析仪Sysmex XT2000i检测血常规,对于MCV<82 fl或MCH<27 pg或 MCHC<320 g/L的患者采用碱性琼脂糖凝胶电泳法在Helena Spife 3000分析仪上做血红蛋白电泳分析。 
  基因诊断:对于HbA2升高或有异常血红蛋白电泳带的患者,采用深圳亚能生物技术有限公司的β地中海贫血基因诊断试剂盒,按说明书操作提取DNA,在Bio-Rad iCycler PCR仪上基于聚合酶链反应技术扩增出613、423 bp 2个片段,再用反向点杂交技术杂交显色,检测中国人常见的17种β地中海贫血基因突变。 
  1.3 基因测序 
  对于未检测出常见的17种β地中海贫血突变的患者,用Qiagene试剂盒纯化DNA,在ependoff gradient PCR仪上扩增β球蛋白基因,在ABI 3730测序仪上直接基因测序,测序范围为上游至-126,下游至终止密码子后230碱基处,参考序列为U01317,用DNAman和Chromas软件分析测序结果。 
  1.4 产前诊断 
  对于发现携带稀有β地中海贫血突变的患者,若其配偶携带有β地中海贫血突变,提供遗传咨询。在签署知情同意书后,于孕16~21周,在B超引导下采用PTC穿刺针经母腹部抽取羊水5 ml或于孕18~24周抽取脐血1 ml,提取并纯化DNA,进行基因测序。 

  2 结果 
  2.1 A夫妇基因序列结果 
  筛查A夫妇中丈夫血常规MCV 67.5 fl,MCH 20.5 pg,MCHC 303.0 g/L,血红蛋白电泳HbA2为7.10%。反向点杂交显色发现41-42(-TTCT)杂合突变,如图1。A孕妇血常规Hb 90.0 g/L,MCV 67.3 fl,MCH 19.9 pg,MCHC 296.0 g/L,在外院血红蛋白电泳检测报告有21.55%的异常带。反向点杂交显色未发现常见的17种β地中海贫血突变。基因测序结果为CD6(GAG→AAG)/N杂合突变,如图2。在提供遗传咨询后,于孕17周抽取羊水。基因测序结果发现胎儿为CD6(GAG→AAG)/N杂合突变,如图3,但是没有携带41-42(-TTCT)突变。 

  2.2 B夫妇基因序列结果 
  筛查B夫妇的丈夫血常规未发现异常,但血红蛋白电泳发现有G带42.73%,反向点杂交显色未发现常见的17种β地中海贫血突变,基因测序结果为CD22 (GAA→GCA)/N,如图4。B孕妇血常规RBC 5.71×1012/L,MCV 71.6 fl,MCH 21.2 pg,MCHC 292 g/L,血红蛋白电泳发现有J带47.53%,反向点杂交显色未发现常见的17种β地中海贫血突变,基因测序结果为CD56 (GGC→GAC)/N,如图5。在提供遗传咨询后,于孕20周抽取脐血,基因测序结果发现胎儿未遗传父母的两种β地中海贫血基因突变。 

  3 讨论 
  地中海贫血是一组常染色体隐形遗传病。它是由于珠蛋白基因突变,使珠蛋白生物合成受阻、产量不足或缺如所致,导致慢性溶血或严重缺氧致死,是我国长江以南各省发病率最高、影响最大的遗传病之一[1]。常见有两种类型:α地中海贫血和β地中海贫血。由于目前对地中海贫血尚无有效的治疗方法,一般依赖频繁地输血和去铁治疗赖以维持生命,且一般在成年前夭折,因此加强婚前检查和产前检查、进行遗传咨询,为夫妇双方均为地中海贫血基因携带者的孕妇,在妊娠早期抽取羊水或脐血进行产前基因诊断,防止中、重型地中海贫血患儿的出生,减少杂合子胎儿的出生。是最有效的预防措施,可以提高人口素质、减轻家庭和社会精神和经济负担[2]。全世界已发现的β地中海贫血基因突变超过200种[3],我国已报道突变超过30种,我国常见地中海贫血基因突变23种,其中CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、CD17(A→T)、CD71-72(+A)、-28(A→G)、βE(GAG →AAG),占中国人β地中海贫血基因突变总数的80%以上[4-5]。现在一般以基于反向点杂交技术的基因芯片检测中国人常见的17种β地中海贫血基因突变,所以会有一定的漏诊率。而且β地中海贫血基因突变具有异质性,在不同的地区基因突变类型和所占的比例都有所不同[6]。因此,调查本地的基因突变类型和所占的比例,发现当地的稀有突变就显得非常重要。因为当一对夫妇中有一位携带常见的β地中海贫血基因突变,而其配偶携带稀有β地中海贫血基因突变时,由于常规的反向点杂交未发现这个稀有突变,因而错过了产前诊断,但这对夫妇却有四分之一的机会诞生中间型或重型的β地中海贫血患儿。 
  笔者在筛查中发现两对夫妇血常规改变或血红蛋白电泳有异常带,在反向点杂交显色除A丈夫为41-42杂合突变外其他未发现常见的17种β地中海贫血突变,进一步的基因测序发现,A孕妇、B丈夫和B孕妇为稀有β地中海贫血突变的杂合子。然后为A孕妇抽取羊水行产前诊断,基因测序结果表明胎儿为CD6(GAG→AAG)/N杂合突变,为轻型β地中海贫血。B孕妇抽取脐血行产前诊断,基因测序结果表明,没有遗传父母的两种稀有β地中海贫血基因突变,也没有发现其他突变,可以继续妊娠。对β球蛋白基因测序可以有效地发现稀有突变[7],并为携带稀有β地中海贫血突变的夫妇提供产前基因诊断,是常规地中海贫血产前基因诊断的一个重要补充手段,可减少漏诊率。 
   
  [参考文献] 
  [1]黄林环,方群,曾瑞萍,等.地中海贫血胎儿产前基因型诊断结果与血象特点的分析[J].中华儿科杂志,2006,44(10):760-763. 
  [2]Joel Zlotogora.Population programs for the detection of couples at risk for severe monogenic genetic diseases[J].Hum Genet,2009,126:247-253. 
  [3]Kalokairinou EM.The experience of beta-thalassaemia and its prevention in Cyprus[J].Med Law,2007,26:291-307. 
  [4]Mao X.Chinese geneticists’ views of ethical issues in genetic testing and screening: evidence for eugenics in China[J].Am J Hum Genet,1998,63:688-695. 
  [5]周玉球,莫秋华,卢金汉,等.基于社区水平的珠海市大人群地中海贫血的筛查和产前诊断[J].中华医学遗传学杂志,2008,25(3):256-261. 
  [6]Vivian CD,Sandrine C,Mara H.Identification of β thalassemia mutations in South Brazilians[J].Ann Hematol,2008,87:381-384. 
  [7]宋春林,范菊花,郭晓玲.1例新的β地中海贫血稀有突变IVS-Ⅰ-116(T→G)[J].中国当代医药,2010,17(2):106-107. 
  (收稿日期:2010-01-22) 

原文地址:http://www.xzbu.com/6/view-2519029.htm